材料与试剂
冷冻麦管（IMV，catalog number: 005565）移液枪及枪头 （Eppendorf）1.5 ml 离心管（AXYGEN，catalog number：MCT-150-C-S）15 ml 离心管（Corning，catalog number：430791）3.5 cm 培养皿（CORNING，catalog number: 430165）一次性使用无菌注射器带针（KDL 1ml）镊子（吉尔泰）液氮矿物油（Sigma，catalog number：M8410）精子冷冻保护液（Irvine Scientific，catalog number：90128）TH3液（见溶液配方）T3液（见溶液配方）仪器设备
恒温试管架（Cook）培养箱（Thermo Scientific， model：Forma 3111、Forma 371）冰箱（海信）水浴锅（bluepard）离心机 （Eppendorfcentrifuge，model：5702）实验步骤
一、精子冷冻
解冻精子冷冻保护液，放培养箱37 °C加热 30 min，摇匀精子冷冻保护液；将TH3放于37 °C恒温试管架上预热 30 min；提前在精子冷冻麦管上标注好具体信息；将采集的精子放于37 °C恒温试管架上液化15-20 min；将液化好的精子用移液枪吸入1.5 ml 的离心管中，根据精子的液化浓度加入适量的TH3液，即精子液化量与TH3液的总量是三的倍数；按照冷冻保护液：精液等于1:3的比例，用移液枪在离心管内加入冷冻保护液，加冷冻液时应一滴一滴慢慢加，加入一滴就轻摇一下，冷冻液加完后，用移液枪轻轻吹打；用注射器连接上提前标记好的冷冻麦管，先吸一段40 μl的TH3液，再吸一段空气，然后吸80 μl的精子，再吸一段空气，然后再吸40 μl的TH3，最后分别将麦管两头在酒精灯上烧软化后捏紧封口；(见图1） 图1. 精液吸入冷冻麦管后将两头封口先放入4 °C的冰箱内1 h，然后再将麦管放于距液氮面2 cm的液氮蒸汽上30 min，最后放入精子冷冻液氮罐内；做好详细记录。二、精子复苏
提前半小时打开37 °C水浴锅让水温升至37 °C；提前半小时将TH3和T3放于37 °C恒温试管架上预热；用镊子从液氮中取出冷冻麦管，在空气中停留10 s，然后放37 °C的水浴锅中 1 min；加入1 ml TH3液体在 15 ml的离心管内，将精子冷冻麦管两头剪开，用注射器将精子推至TH3液体中，静置 10 min；再加入4 ml TH3 液体在精子离心管内，静置10 min；将精子1,800 rpm，离心5 min，去上清，加入5 ml的T3液体；再将精子1,800 rpm，离心5 min，去上清，加入1 ml的T3液体；再次1,800 rpm，离心5 min，离心后等待精子上游；上游后取中层的精子，在培养皿内制备精子滴，盖上矿物油，放入培养箱待用。溶液配方
Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium with HEPES (TH3)（表1）表1. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium with HEPES (TH3) 配制表成分/100ml/50ml备注NaCl3.329 ml1.665 ml200 mg/ml stockKCl239 μl119.5 μl100 mg/ml stockCaCl2·2H2O294 μl147 μl100 mg/ml stockMgCl2·6H2O102 μl51 μl100 mg/ml stockNaH2PO4 48 μl24 μl100 mg/ml stockNaHCO3 210.6 mg105.3 mgHEPES240 mg120 mgD-Glucose90 mg45 mgSodium Pyruvate12 mg6 mgSodium lactate (60% syrup)0.17 ml85 μlBSA300 mg150 mgpenicillin-streptomycin (100X)1 ml500 μlPhenol Red (0.01%)10 μl5 μlpH7.4Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium without HEPES (T3)（表2）表2. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium without HEPES (T3) 配制表成分/100ml/10ml备注NaCl3.329 ml333 μl200 mg/ml stockKCl239 μl23.9 μl100 mg/ml stockCaCl2·2H2O294 μl29.4 μl100 mg/ml stockMgCl2·6H2O102 μl10.2 μl100 mg/ml stockNaH2PO4 48 μl4.8 μl100 mg/ml stockNaHCO3 210.6 mg21.06 mgGlcose90 mg9 mgSodium Pyruvate12 mg1.2 mgSodium lactate (60% syrup)0.17 ml17 μlBSA300 mg30 mgpenicillin-streptomycin (100X)1 ml100 μlPhenol Red (0.01%)10 μl1 μlpH7.4参考文献
胡京美，许成岩，李媛，耿玲，马刚，王丽，陈子江. 冷冻保护剂与精液比例对冷冻复苏后精子活力的影响. 中华男科学杂志，2009年5期朱文兵，范立青，卢光琇. 不同配比的保护剂对人类精子冷冻复苏后活动能力的影响. 中国现代医学杂志，2005年6月第15卷第11期